Nuevo kit de detección de ácido nucleico del coronavirus (SARS-Cov-2)
New Coronavirus(SARS-Cov-2) Nucleic Acid Detection Kit
(Flumineralscent RT-PCR Probe Method) Product Manual
【Prodart name 】Kit de detección de ácido nucleico del nuevo coronavirus (SARS-Cov-2) (método de sonda fluorescente RT-PCR)
【Packaging specsications 】25 pruebas/kit
【Intended usedad】
Este kit se utiliza para la detección cualitativa de ácido nucleico del nuevo coronavirus en hisopos nasofaríngeos, hisopos orofaríngeos (garganta), hisopos nasales anteriores, hisopos de cornete medio, lavados nasales y aspirados nasales de personas que su proveedor de atención médica sospecha que tienen COVID19. La detección de los genes ORF1ab y N del nuevo coronavirus puede utilizarse para el diagnóstico auxiliar y el seguimiento epidemiológico de la infección por el nuevo coronavirus.
【Principles of the procadure 】
Este kit está diseñado para sondas TaqMan específicas y cebadores específicos diseñados para las secuencias de los genes ORF1ab y N del nuevo coronavirus (SARS-Cov-2). La solución de reacción de PCR contiene 3 conjuntos de cebadores específicos y sondas fluorescentes para la detección específica de objetivos, y se utiliza un conjunto adicional de cebadores específicos y sondas fluorescentes como control estándar interno del kit para detectar genes de mantenimiento endógenos.
El principio de la prueba es que la sonda fluorescente específica es digerida y degradada por la actividad exonucleasa de la enzima Taq en la reacción de PCR, de modo que el grupo fluorescente informador y el grupo fluorescente apagado se separen, de modo que el sistema de monitoreo de fluorescencia pueda recibir una sonda fluorescente. señal, y luego a través del efecto de enriquecimiento de la amplificación por PCR, la señal de fluorescencia de la sonda alcanza un valor umbral establecido: valor Ct (umbral de ciclo). En el caso de que no haya ningún amplicón objetivo, el grupo indicador de la sonda está cerca del grupo de extinción. En este momento, se produce la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia y el grupo de extinción apaga la fluorescencia del grupo indicador, de modo que el instrumento de PCR fluorescente no puede detectar la señal fluorescente.
Para controlar el uso de reactivos durante la prueba, el kit está equipado con controles positivos y negativos: el control positivo contiene el plásmido recombinante del sitio objetivo y el control negativo es agua destilada, que se utiliza para controlar la contaminación ambiental. Se recomienda configurar un control positivo y un control negativo simultáneamente durante la prueba.
【Main components 】
| Cat. No. | BST-SARS-25 | BST-SARS-DR-25 | componenteentes | |
| Name | Especulaciónificación | cuantitativoidad | cuantitativoidad | |
| control positivo | 180 μl/vial | 1 | 1 | Plásmidos construidos artificialmente, Agua destilada |
| control negativo | 180 μl/vial | 1 | 1 | Agua destilada |
| Mezcla de SARS-Cov-2 | 358,5 μl/vial | 1 | / | Pares de cebadores específicos, sondas fluorescentes de detección específicas, dNTPs, MgCl2, KCl, Tris-Hcl, Agua destilada, etc. |
| Mezcla de enzimas | 16,5 µl/vial | 1 | / | Enzimas Taq, transcriptasa inversa, enzimas UNG, etc. |
| Mezcla SARS-Cov-2 (liofilizada) | 25 pruebas/vial | / | 1 | Pares de cebadores específicos, sondas fluorescentes de detección específicas, dNTPs, enzimas Taq, transcriptasa inversa, agua destilada, etc. |
| 2x búfer | 375 μl/vial | / | 1 | MgCl2, KCl, Tris-Hcl, Agua destilada, etc. |
Nota:(1) Los componentes de diferentes kits de lotes no se pueden mezclar ni intercambiar.
(2) Prepare su propio reactivo: kit de extracción de ácidos nucleicos.
【Storage conditions y expiration date 】
For BST-SARS-25:Transporte y almacene a -20 ± 5 ℃ durante mucho tiempo.
For BST-SARS-DR-25:Transporte a temperatura ambiente. Almacenar a -20 ± 5 ℃ durante mucho tiempo.
Evite ciclos repetidos de congelación y descongelación. El período de validez se fija provisionalmente en 12 meses.
Consulte la etiqueta para conocer la fecha de fabricación y uso.
Después de la primera apertura, el reactivo se puede almacenar a -20 ± 5 °C durante no más de 1 mes o hasta el final del período del reactivo, la fecha que ocurra primero, para evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación y el número de congelaciones del reactivo. -los ciclos de descongelación no deben exceder de 6 veces.
【Applicable instrument】ABI 7500, SLAN-96P, Roche-LightCycler-480.
【Sample requirements 】
1.Tipo de muestra aplicable: solución de ácido nucleico extraída.
2.Almacenamiento y transporte de muestras: Almacene a -20 ± 5 ℃ durante 6 meses. Congele y descongele las muestras no más de 6 veces.
【Testing metcapacho】
1.Nucleic acid extraction
Seleccione un kit de extracción de ácido nucleico adecuado para extraer ácido nucleico viral y siga las instrucciones del kit correspondiente. Se recomienda utilizar un kit de purificación y extracción de ácidos nucleicos producido por Yixin Bio-Tech (Guangzhou) Co., Ltd. o un kit de purificación de ácidos nucleicos equivalente.
2. Rcada unotion reaccionnt preparation
2.1 For BST-SARS-25:
(1) Retire la mezcla de SARS-Cov-2 y la mezcla de enzimas, derrita completamente a temperatura ambiente, mezcle bien con el dispositivo Vortex y luego centrifugue brevemente.
(2) Se agregaron 16,5 uL de mezcla de enzimas a 358,5 uL de mezcla de SARS-Cov-2 y se mezclaron bien para obtener la solución de reacción mixta.
(3) Prepare un tubo octal de PCR de 0,2 ml limpio y márquelo con 15 uL de la solución de reacción mixta anterior por pocillo.
(4) Agregue 15 μL de solución de ácido nucleico purificada, el control positivo y el control negativo, y cubra con cuidado la tapa del tubo octal.
(5) Mezcle bien invirtiéndolo boca abajo y centrifugue rápidamente para concentrar el líquido en el fondo del tubo.
1
2.2 For BST-RAES-DR-25:
(1) Agregue 375 ul de tampón 2x a la mezcla de SARS-Cov-2 ((liofilizada) para preparar la mezcla de reacción. Mezcle bien pipeteando y luego centrifugue brevemente. （Una vez preparada la mezcla de reacción, se recomienda almacenar a -20 ℃ a almacenamiento a largo plazo).
(2) Prepare un tubo octal de PCR de 0,2 ml limpio y márquelo con 15 μl de mezcla de reacción por pocillo.
(3) Agregue 15 μl de solución de ácido nucleico purificada, el control positivo y el control negativo, y cubra con cuidado la tapa del tubo octal.
(4) Mezcle bien invirtiéndolo boca abajo y centrifugue rápidamente para concentrar el líquido en el fondo del tubo.
3. PCR amplification (Consulte el manual del instrumento para conocer los ajustes de funcionamiento.）
3. 1 Coloque el tubo de PCR 8 en la cámara de muestras del instrumento de PCR fluorescente y configure la muestra a analizar, el control positivo y el control negativo según el orden de carga.
3.2 Canal de detección de fluorescencia:
(1) El gen ORF1ab selecciona el canal de detección de FAM (Reportero: FAM, Quencher: Ninguno).
(2) El gen N selecciona el canal de detección de VIC (Reportero: VIC, Quencher: Ninguno).
(3) El gen estándar interno selecciona el canal de detección de CY5 (Reportero: CY5, Quencher: Ninguno).
(4) La referencia pasiva se establece en ROX.
3.3 Configuración de parámetros del programa PCR:
| Paso | Temperatura (℃) | Tiempo | Número de ciclos | |
| 1 | Reacción de transcripción inversa | 50 | 15 minutos | 1 |
| 2 | Activación de la enzima Taq | 95 | 2,5 minutos | 1 |
| 3 | Activación de la enzima Taq | 93 | 10 segundos | 43 |
| Extensión de recocido y adquisición de fluorescencia. | 55 | 30 segundos | ||
Después de la configuración, guarde el archivo y ejecute el programa de reacción.
4.Results analysis
Una vez finalizado el programa, los resultados se guardan automáticamente y se analiza la curva de amplificación. La curva de amplificación se establece en el umbral predeterminado del instrumento.
【Explanation of test resues 】
1. Determine la validez del experimento: el canal FAM y VIC de control positivo debe tener una curva de amplificación típica y el valor Ct generalmente es inferior a 34, pero puede fluctuar debido a diferentes configuraciones de umbral de diferentes instrumentos. El canal FAM, VIC de control negativo debe ser Ct no amplificado. Se acuerda que los requisitos anteriores deben cumplirse al mismo tiempo, de lo contrario esta prueba no será válida.
2. Juicio de resultados
| Canal FAM/VIC | Resultado del juicio |
| Ct<37 | La prueba de muestra es positiva |
| 37≤Ct<40 | La curva de amplificación tiene forma de S y es necesario volver a examinar las muestras sospechosas; si los resultados del nuevo examen son consistentes, se considera positivo; de lo contrario, es negativo |
| Ct≥40 o sin amplificación | La prueba de la muestra es negativa (o está por debajo del límite inferior de detección del kit) |
Nota: (1) Si tanto el canal FAM como el canal VIC son positivos al mismo tiempo, se determina que el SARS-Cov-2 es positivo.
(2) Si el canal FAM o el canal VIC es positivo y el otro canal es negativo, se debe repetir la prueba. Si es positivo al mismo tiempo, se considerará positivo para SARS-Cov-2; de lo contrario, se considerará negativo para SARS-Cov-2.
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